传统基因扰动筛选的局限性

 

在生命科学研究中，基因扰动筛选（perturbation screening）是探索基因功能和表型联系的关键工具。通过随机扰动细胞中的基因组并筛选出与特定生物学现象相关的基因，研究人员能够解码复杂的遗传网络。然而，传统的基因筛选方法尽管推动了基因组研究的发展，但仍面临诸多挑战：

 

1. **富集策略依赖**：传统方法大多依赖荧光标记或细胞分选技术（如FACS）对特定表型的细胞进行筛选，随后通过下一代测序（NGS）识别这些细胞中的基因扰动因子（如CRISPR单链向导RNA, sgRNA）。这种方法的效率高度依赖于细胞的转录活性和胞质体积。

   

2. **低转录活性细胞类型**：在低转录活性的细胞类型（如原代细胞）中，信号可能不足，难以进行精确分析。

 

3. **高细胞密度环境下的挑战**：传统方法通常需要将细胞分离到单独的孔或空间中进行测定，这种操作不仅繁琐，还容易引入实验偏差。在高细胞密度环境中，准确定位基因扰动的来源也极具挑战性。

 

  NIS-Seq技术的突破与优势

 

为了克服上述瓶颈，研究人员开发了一种创新技术——核内原位测序（Nuclear In-Situ Sequencing, NIS-Seq），其显著特点在于通过在细胞核内生成亮度极高的测序信号，实现了细胞类型不可知的高密度光学筛选。

 

  核心原理

 

NIS-Seq的核心原理围绕在细胞核内生成明亮且稳定的信号。传统的原位测序依赖于细胞胞质中的信使RNA（mRNA），而NIS-Seq则将信号生成的过程转移到了细胞核内，关键在于引入了T7反向转录系统：

 

- **T7反向转录系统**：研究人员在单链向导RNA（sgRNA）表达盒中添加了反向的T7启动子，从而使大量sgRNA的RNA拷贝能够直接从基因组DNA转录生成。这些RNA拷贝通过逆转录形成cDNA，并进一步通过锁环延伸（padlock elongation）、连接（ligation）和滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）生成显著增强的信号。

 

- **多轮荧光测序**：NIS-Seq采用三色激光合成测序，每轮测序生成的信号能够明确地标记单细胞核内的基因扰动条形码。这种方法不仅在单细胞水平上提供了极高的分辨率，还避免了传统方法在高细胞密度环境中信号分配模糊的问题。例如，在实验中，研究人员对THP1来源的巨噬细胞进行了14轮测序，生成了精准且一致的核内荧光信号，为基因扰动的高效识别奠定了基础。

 

 技术验证与应用

 

研究团队在包括HeLa细胞、THP1来源的巨噬细胞和初级人巨噬细胞在内的八种细胞类型中对NIS-Seq进行了验证，结果显示其在高密度细胞筛选和复杂库映射方面表现出极高的准确性和适用性。此外，该技术不仅被应用于解码炎症相关通路的关键基因，还成功完成了在原代人巨噬细胞中的小规模筛选，甚至实现了在人皮肤组织中的条形码识别。

 

  NIS-Seq的应用前景

 

NIS-Seq技术展示了在基础研究和临床转化中的广阔前景，特别是在以下领域：

 

- **细胞迁移**：研究细胞如何响应外部信号进行迁移，揭示癌症转移机制。

- **蛋白质复合物形成**：解析蛋白质相互作用网络，理解疾病发生机制。

- **动态信号转导**：探索细胞内外信号传递路径，发现新的治疗靶点。

 

通过这些技术创新，NIS-Seq显著提高了基因组筛选的效率和广泛适配性。它突破了传统技术对细胞类型和转录活性的限制，使得在低活性细胞和原代细胞中也能稳定生成清晰信号，为探索基因功能开辟了全新路径。这项技术有望成为未来基因扰动筛选的主流工具，引领基因组学研究进入新时代。