近日，美国斯坦福大学的Steven M. Banik团队在《自然》（*Nature*）上发表了一篇题为《通过蛋白质运输耦合实现靶向蛋白重定位》（*Targeted protein relocalization via protein transport coupling*）的研究论文。该研究开发了一种创新的化学生物学工具——靶向重定位激活分子（TRAM），通过结合穿梭蛋白的转运来控制目标蛋白的亚细胞定位。这一技术不仅为理解细胞内蛋白质动态提供了新视角，还为治疗蛋白质定位异常相关疾病提供了新的策略。

 

#### 研究背景

 

蛋白质的亚细胞定位对其功能至关重要。核定位序列（NLS）和核输出序列（NES）可被karyopherin蛋白家族识别，以调节货物在细胞核和细胞质之间的双向运输。然而，要通过蛋白质运输耦合的方式来克服蛋白质的固有定位，需要满足两个条件：（1）在穿梭蛋白上有一个足够强的相反定位序列；（2）穿梭蛋白的必要化学计量比。

 

#### 技术原理与实验设计

 

1. **模型蛋白的选择**：

   - 研究人员选择了烟酰胺核苷酸腺苷基转移酶1（NMNAT1）作为模型蛋白进行重新定位研究。NMNAT1只有一个预测的NLS且没有已知的直接DNA结合域，因此可能容易受到小分子介导的重新定位的影响。

 

2. **TRAM的设计与合成**：

   - 研究人员合成了双功能分子TRAM 1，其能够与大肠杆菌二氢叶酸还原酶结构域（EcDHFR）和FKBP12F36V结构域结合。这些结构域因其与大多数哺乳动物蛋白的紧密结合亲和力和正交性而被广泛使用。

 

3. **穿梭蛋白的构建与验证**：

   - 研究人员生成了mCherry融合EcDHFR和来自HIV-1 REV蛋白的NES作为穿梭蛋白，并在HeLa细胞中稳定地整合了mCherry-EcDHFR-NES和FKBP12F36V-GFP-NMNAT1。实验结果显示，在TRAM 1的介导下，NMNAT1表现出剂量依赖性地向细胞质的转移。

 

#### 定量分析方法

 

为了准确评估蛋白质的重新定位，研究人员开发了一个定制的计算成像分析流程，能够在单细胞级别独立地在细胞核和细胞质中对两种不同蛋白质进行分析。这种方法适用于不同的细胞类型和密度，能够检测剂量、穿梭蛋白和化学计量依赖的再定位。

 

#### 应用与验证

 

1. **多种内源蛋白的重新定位**：

   - 研究人员使用核激素受体（如雌激素受体ERα和糖皮质激素受体GR）作为穿梭蛋白，检测了三种已知在疾病中表现出异常定位的突变蛋白——SMARCB1Q318X、TDP43ΔNLS和FUSR495X——的重新定位能力。结果显示，不同的突变蛋白对ERα介导的重新定位的敏感性不同，TDP43ΔNLS和FUSR495X比SMARCB1Q318X更容易被ERα重新定位。

 

2. **内源性蛋白的重新定位**：

   - 研究人员采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将结合域和荧光蛋白标签插入到内源性蛋白PRMT9、SOS1和FKBP12上，使用metaP2和PARP1作为内源性细胞质和核的穿梭蛋白，并合成了能够与它们结合的TRAM 11-13。实验结果证明，即使在内源性蛋白表达水平下，通过TRAM介导的内源性蛋白重新定位也是可行的。

 

3. **体外模型的应用**：

   - 研究人员使用TRAM 1处理转导了携带mNMNAT1和EcDHFR标签的腺相关病毒（AAV）的大鼠胚胎的背根神经节（DRG）神经元，发现TRAM 1可以促进NMNAT1从细胞核向轴突的重新定位，NMNAT1在轴突中的表达得到了维持，即使在轴突损伤后也能观察到轴突的健康状况和轴突末端的保护。

 

#### 结论与展望

 

本研究开发了一种定量的单细胞分析方法来检查通过TRAM介导的目标蛋白与穿梭蛋白的耦合潜力，展示了两种蛋白质伙伴的相对表达水平是推动目标蛋白重新定位能力的主要参数。通过与内源性穿梭蛋白的耦合，可以改变内源性目标蛋白的定位。这一技术为治疗蛋白质定位异常相关疾病提供了新的可能性。通过精确控制蛋白质的定位，不仅可以纠正因蛋白质错位导致的疾病表型，还可以通过蛋白质重新定位赋予有益的功能，更细致地调节细胞功能，从而扩大治疗选择的范围，为开发新的治疗方法提供了理论基础和实验策略。