在这项研究中，研究人员试图系统地评估插入序列的长度和组成、细胞系、目标位点以及不同版本的主编辑器如何影响插入效率。

 

  为此，他们总共构建了3604 个pegRNA，编码长度从1 nt 到69 nt 不等且GC 含量不同的预切口插入片段。他们将序列插入两个细胞系（HEK293T 和HAP1 细胞），靶向四个目标位点（HEK3、EMX1、FANCF 和CLYBL）。一周后，他们对细胞的基因组进行了测序，以确保编辑成功。

 

  由于插入速度相差三个数量级，研究人员试图从插入长度开始了解相关特征。他们在HEK293T细胞中发现了两个特点：3和4核苷酸序列的插入速度比其他序列快； 15-21个核苷酸的序列插入率高于周围序列。然而，在HAP1 细胞中，1-4 b.p. 的短序列插入率。不高于较长序列。他们将此归因于错配修复(MMR) 系统，因为HEK293T 细胞部分缺乏MMR。这在MLH1 错配修复基因被敲除的HAP1 细胞中也得到了证明，表明MMR 系统可以阻止短序列的插入。

 

  之后，他们分析了初级编辑的各个阶段如何影响插入序列的速度。他们发现，如果pegRNA 包含四个或更多连续的腺嘌呤，插入率会显着降低。此外，另一个重要的引物编辑步骤是实现具有5'-翻转（包含野生型序列）和3'-翻转（包含插入）的中间体之间的平衡，而5'-翻转核酸酶FEN1 和3 ' -翻转核酸酶FEN1。 TREX1 和TREX2 核酸酶提供了这种平衡。他们发现3'-flap 核酸酶TREX1 和TREX2 抑制了较长序列的插入。

 

  同时，插入序列的核苷酸组成和二级结构也会影响插入率。研究人员发现，主要的编辑系统明显偏爱胞嘧啶。插入序列中胞嘧啶每增加1%，插入率平均增加2.2%。相反，腺嘌呤和胸腺嘧啶的百分比降低了每个位点的插入率。此外，他们发现可以更有效地插入具有更高结构强度的序列。

 

  为此，他们使用了Twist Bioscience 提供的寡核苷酸库。据Twist介绍，他们独特的硅基DNA合成平台可以在一次运行中生成超过一百万个寡核苷酸，数量几乎没有限制，而且寡核苷酸池准确且均匀，让人们对实验结果充满信心。 信心。此外，实验中使用的几种载体和基因片段也由Twist Bioscience提供。

 

  了解了影响插入率的许多因素后，研究人员希望预测在同一位置插入不同序列的效率。他们应用机器学习方法并选择了10 个特征来训练数据，包括插入序列的长度、组成、pegRNA 二级结构和MMR。这种称为MinsePIE 的方法能够很好地预测测试数据插入性能，相关性达到0.68（图2）。

 

  在对现有数据进行训练后，他们在新数据上测试了MinsePIE 模型，发现它能够准确预测多个插入序列的成功概率。随后，他们还通过实验测试了预测的序列。与预测较低插入率的密码子变体相比，预测较高插入率的密码子变体确实表现出更高的插入率，这凸显了MinsePIE 模型在密码子优化方面的强大功能。研究人员认为，这种计算模型可以帮助人们选择最有效的序列写入他们的基因组。

 

  最后，研究人员就如何提高主编辑系统的插入效率提出了几点建议。他们建议选择胞嘧啶含量高且易于形成二级结构的序列。对于使用U6 启动子的pegRNA，尽量避免插入腺嘌呤。对于少于14 个核苷酸的序列，瞬时MMR 抑制或MLH1 敲除将大大提高插入效率。总的来说，这项工作扩展了我们对短序列插入效率的理解，并展望了复杂的基因组工程和纠正各种致病突变的前景。